血浆游离DNA（cfDNA）已被用于监测基因突变和诊断肿瘤。由于甲状旁腺肿瘤的临床特征存在重叠，术前鉴别甲状旁腺癌（PC）与甲状旁腺腺瘤（PA）存在较大难度。本研究旨在检测术前PC和PA患者血浆样本中的cfDNA突变情况，以预测肿瘤组织中的CDC73基因状态，为甲状旁腺肿瘤的鉴别诊断提供依据。本研究纳入18例PC患者和13例PA患者，采用下一代测序技术（NGS）检测患者血浆cfDNA，并以匹配的外周血白细胞DNA作为对照。通过全外显子测序检测CDC73基因突变或肿瘤组织免疫组化法检测副纤维蛋白表达。采用逻辑回归分析评估cfDNA突变对预测肿瘤组织CDC73基因状态及鉴别诊断的价值，将CDC73基因突变或副纤维蛋白（parafibromin）表达缺失定义为CDC73异常。
1例PC患者因无肿瘤标本未进行CDC73异常检测。13例PA患者的肿瘤组织均未检测到CDC73异常，而17例有标本的PC患者中，10例存在CDC73异常（P=0.001）。在这10例CDC73异常的PC患者中，8例的血浆cfDNA中检测到CDC73基因突变；在20例肿瘤组织无CDC73异常的患者中，4例的血浆cfDNA中检测到该基因突变。以血浆cfDNA中的CDC73状态预测肿瘤组织的CDC73异常，受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.80（95%CI：0.622-0.978）；预测肿瘤恶性程度，AUC为0.795（95%CI：0.632-0.958）。
展开剩余92%本研究首次尝试通过血浆cfDNA深度测序评估甲状旁腺肿瘤的基因突变状态，该方法或可为术前识别PC提供助力。
研究背景
原发性甲状旁腺功能亢进症（PHPT）是一种常见的内分泌疾病，由甲状旁腺腺瘤（PA）、甲状旁腺增生或甲状旁腺癌（PC）导致甲状旁腺组织分泌过量甲状旁腺激素（PTH）引起。其中PA约占PHPT病例的85%，PC则是一种罕见的恶性肿瘤，预后较差，占PHPT病例的1%-5%。尽管PC患者的10年总生存率为49%-91%，但约60%的患者会出现复发和转移。手术仍是PHPT的主要治疗方式，为降低复发风险，PC患者需接受包括甲状旁腺病变组织和同侧甲状腺叶在内的整块切除术，而良性PA患者仅需行局部切除术，因此术前精准诊断对确定手术切除范围至关重要。然而，由于PC与PA的临床特征存在重叠，术前鉴别两者难度较大。颈部可触及直径大于3cm的肿块、血清PTH水平高于正常值10倍、血钙水平超过3.5mmol/L的患者，患PC的可能性更高。但仅凭临床和生化分析进行鉴别诊断的效果并不理想，PC术前常被误诊为PA。其确诊需术后通过组织学检查，如包膜侵犯、血管浸润、神经受累及肿瘤侵犯邻近组织等指标判断。此外，在发展中国家，许多PA患者因诊断延误也可能出现严重的病情表现。经皮细针穿刺活检已成为甲状腺癌等多种肿瘤术前诊断的标准方法，但由于存在肿瘤破裂、出血及肿瘤细胞扩散的风险，该方法并不推荐用于甲状旁腺肿瘤的诊断，相关确凿证据的研究也较为缺乏。因此，临床上亟需一种可靠的甲状旁腺肿瘤术前鉴别诊断方法。
已有多项研究尝试寻找血清生物标志物（如外泌体microRNA）以鉴别甲状旁腺良恶性肿瘤，但这些方法因检测标准化难度大，难以在临床推广应用。PC对血清PTH水平的影响较PA更显著，目前多数医疗中心采用二代或三代检测技术分析PTH水平，且有研究报道PC与PA患者的二代、三代PTH检测值比值存在差异，但这些方法的诊断效能仍不尽如人意，且尚无后续研究验证其结果。
CDC73基因（原HRPT2基因）与甲状旁腺功能亢进-颌骨肿瘤综合征（HPT-JT综合征）相关，该综合征为常染色体显性遗传病。CDC73基因编码的副纤维蛋白是聚合酶相关因子1复合物的组成部分，在调控基因转录和组蛋白修饰中发挥关键作用。CDC73基因的失活突变会导致PC细胞内核的副纤维蛋白免疫组化（IHC）染色阴性。约60%的PC存在CDC73基因突变，而PA中该基因突变的发生率极低。CDC73基因失活突变导致的副纤维蛋白表达缺失，被认为是鉴别PC与PA的潜在标志物，且副纤维蛋白表达缺失与PC的复发密切相关。因此，CDC73基因是与PC相关的关键基因，研究者建议若肿瘤组织的副纤维蛋白染色阴性，需对CDC73基因进行测序以检测胚系突变。目前，临床医生和研究者已认识到，下一代测序（NGS）是检测基因突变的核心技术。
血浆游离DNA（cfDNA）已被证实是诊断和治疗肺癌、结直肠肿瘤、胰腺癌等多种恶性肿瘤的潜在生物标志物。cfDNA是人体各类细胞（包括肿瘤细胞和正常细胞）释放到循环系统中的DNA物质，经核酸酶降解为约160个核苷酸的短双链DNA片段，存在于血液中，半衰期为5-150分钟。通过捕获、富集并测序血液中循环的肿瘤细胞释放的DNA分子，可明确人体肿瘤等各类组织的基因突变状态。基于cfDNA在肿瘤诊断中的优势，本研究首次对甲状旁腺肿瘤开展相关初步探索。
本研究旨在验证通过血液cfDNA检测甲状旁腺肿瘤的可行性，通过对患者血清样本进行回顾性NGS检测，识别潜在的基因突变，为甲状旁腺肿瘤提供更全面的分子特征分析。术前监测血浆cfDNA中的CDC73突变状态，或可为评估肿瘤组织中的CDC73基因突变情况提供线索。本研究将结合血浆cfDNA的基因突变状态、临床特征及生化分析结果，构建预测模型，以推断肿瘤组织的突变状态，助力甲状旁腺恶性肿瘤的识别。
研究结果
研究队列患者的临床特征：
本研究共纳入31例患者，其中男性4例、女性27例，样本采集时的平均年龄为48.6±12.3岁。PC组与PA组患者在性别、年龄、体质量指数（BMI），以及血清PTH、钙、碱性磷酸酶（ALP）、磷、肌酐水平方面，差异均无统计学意义（表1）。随访期间，15例PC患者出现复发或转移。
表1
cfDNA的基因突变与浓度：
PC组患者血浆样本的平均DNA浓度高于PA组，但差异无统计学意义（PC组：1.56±1.92μg/ml，PA组：0.81±0.53μg/ml，P=0.128）。本研究中cfDNA的平均去重测序深度为1774×（范围：903×-2790×），两组间的总测序读数和cfDNA有效测序深度比较，差异均无统计学意义（P=0.064、P=0.850）。每份血浆样本的cfDNA中平均检测到9.5个基因的28.7个基因变异（图1）。对于整个队列，未发现突变基因变异（P = 0.95）或基因突变数量（P = 0.12）的显著差异。
图1
甲状旁腺肿瘤组织中的CDC73突变状态：
30例患者有肿瘤组织的CDC73基因突变检测结果。研究者将CDC73基因突变或副纤维蛋白表达缺失定义为CDC73异常。1例PC患者因无肿瘤标本未检测。17例PC患者中，10例的肿瘤组织检测到CDC73异常，13例PA患者的肿瘤组织均未检测到该异常（P=0.001）。这10例CDC73异常的PC患者均存在副纤维蛋白表达缺失（图2），其中6例存在CDC73基因突变，包括2例种胚系突变、4例体细胞突变。
图2
利用cfDNA预测甲状旁腺肿瘤组织的CDC73突变状态：
1例PA患者和12例（66.7%）PC患者的血浆cfDNA中检测到CDC73基因突变。10例肿瘤组织存在CDC73异常的患者中，8例的血浆cfDNA中检测到该基因突变；值得注意的是，5例仅存在体细胞CDC73基因突变的患者，其肿瘤组织与血浆cfDNA中的CDC73基因基因型不一致。1例无肿瘤测序标本的PC患者，其血浆cfDNA中检测到CDC73基因突变。20例肿瘤组织无CDC73异常的患者中，4例的血浆cfDNA中检测到该基因突变。通过对血浆cfDNA中CDC73基因进行深度测序，预测甲状旁腺肿瘤组织CDC73异常的灵敏度和特异度均为80.0%，cfDNA中其他基因的突变与肿瘤组织的CDC73基因突变无相关性。逻辑回归分析结果显示，血浆cfDNA的CDC73突变状态可用于预测甲状旁腺肿瘤组织的CDC73基因状态，受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.800（95%CI：0.622-0.978）；将患者年龄、血清PTH水平等临床指标纳入逻辑回归模型后，AUC升至0.935（95%CI：0.841-1.000，图3A）。
图3
利用cfDNA预测甲状旁腺肿瘤的恶性程度：
逻辑回归分析结果显示，在40个检测基因中，仅血浆cfDNA的CDC73突变状态与患者肿瘤组织的CDC73基因状态相关。以cfDNA的CDC73突变状态评估甲状旁腺肿瘤的恶性潜能，AUC为0.795（95%CI：0.632-0.958，图3B）；将临床指标纳入预测模型后，年龄也被证实可用于鉴别甲状旁腺良恶性肿瘤，该模型的AUC为0.889（95%CI：0.764-1.000，图3B）。
讨 论
尽管PC的发病率较低，但由于我国人口基数大，且血清PTH检测技术已广泛应用，近年来我国PC患者数量增长迅速。临床中亟需一种术前鉴别诊断方法，以确定患者的手术切除范围，为治疗决策提供依据。
笔者团队此前曾对比PA与PC的线粒体DNA差异，因线粒体DNA拷贝数较高，在血浆或血清中被检测到的可能性更大，但未发现两者的线粒体DNA存在可用于术前鉴别诊断的特异性突变特征。后续研究重点转向基因组DNA，在PC中鉴定出一系列相关基因及基因变异，其中CDC73基因是最具潜力的候选基因。
由于PC或巨大PA患者的血清PTH水平均可能显著升高，液体活检或可成为监测PC的有效手段。据笔者所知，本研究首次探索利用cfDNA状态预测甲状旁腺肿瘤组织的基因突变情况，对18例PC患者和13例PA患者血浆cfDNA中的40个基因进行突变状态检测。已有研究证实CDC73基因突变与PC发病风险升高相关。
通过深度测序，本研究在血浆cfDNA中鉴定出17个基因的一系列突变，其中最重要的为CDC73基因突变，这一结果或可揭示甲状旁腺肿瘤的基因信息，也证实了CDC73基因的体细胞失活变异是PA中最常见的变异类型。文献回顾显示，40%-100%的散发性PC患者存在体细胞CDC73基因突变，而约40%的CDC73基因突变患者为胚系突变。本研究也在2例患者中检测到胚系突变，这提示临床医生需关注其家属的疾病筛查与管理。在本研究的小样本队列中，10例肿瘤组织CDC73异常的患者中，8例的血浆cfDNA中检测到CDC73基因突变，灵敏度达80.0%；血浆cfDNA的突变状态预测肿瘤组织CDC73异常的AUC为0.80，提示cfDNA有望用于鉴别伴/不伴CDC73基因突变的甲状旁腺肿瘤。值得注意的是，2例存在CDC73基因胚系突变的患者，其血浆cfDNA中均检测到相应突变。多项研究表明，血浆cfDNA中的某些基因突变与肿瘤组织高度一致，这一优势使cfDNA检测成为评估非小细胞肺癌患者EGFR突变状态、筛选EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗适用人群的有效方法。但本研究中，存在体细胞CDC73基因突变的患者，其血浆cfDNA与肿瘤组织中的CDC73基因型均不一致。在肿瘤负荷较低等情况下，cfDNA检测的灵敏度可能低于肿瘤组织检测，而cfDNA基因突变与肿瘤组织基因突变状态的关联机制目前尚不明确，有待进一步研究阐明。
基于血浆cfDNA诊断肿瘤存在一定难度，原因在于cfDNA浓度低、片段短，且绝大部分cfDNA来源于人体正常细胞。本研究中，2例PC患者（PC11、PC16）的血浆cfDNA中未检测到CDC73基因突变，但其肿瘤组织中CDC73基因编码的副纤维蛋白染色为阴性；此外，5例仅存在体细胞CDC73基因突变的PC患者，其肿瘤组织与血浆cfDNA中的CDC73基因型不一致。多种生物学因素会影响cfDNA的检测率，例如患者特征、肿瘤大小、感染等因素可影响cfDNA浓度，肿瘤状态、肿瘤与循环系统的连通性可影响DNA质量。此外，目前的cfDNA检测方案主要用于检测点突变（SNVs）和小片段插入缺失（≤50nt），对于基因融合、大片段插入缺失、拷贝数变异（CNVs）等其他基因组变异，短读长（<300bp）的NGS技术难以检测。肿瘤组织与cfDNA的基因型差异，也可能源于循环肿瘤DNA携带的基因组不完整。本研究发现，GNAS、MEN1、RNF43、EZH2是甲状旁腺肿瘤中突变率较高的基因。31例患者样本中，所有患者均存在GNAS和MEN1基因突变。仅1例患者未检测到RNF43基因突变、2例患者未检测到EZH2基因突变。这一结果可能与背景突变相关。已有研究证实，MEN1基因确实是与PA相关的常见基因，遗传性多发性内分泌腺瘤1型综合征中即存在该基因突变。笔者推测，所有患者均存在MEN1基因突变，可能部分源于克隆性造血产生的残留cfDNA片段，而这些片段并非疾病的驱动因素。因此，这些基因的突变状态无法有效用于甲状旁腺良恶性肿瘤的鉴别。正常细胞和良性组织中也可能存在基因变异，其成因包括环境暴露、细胞自然修复过程等，这些变异并非肿瘤的驱动突变，其是否为该疾病背景下的功能性驱动突变，或仅为无临床意义的偶发发现，仍需进一步研究明确。有研究显示，97%的胰腺癌存在KRAS基因突变，但即使是转移性胰腺癌患者，其18%的循环肿瘤细胞仅携带野生型KRAS等位基因。另一种可能性是，这些病变并非恶性肿瘤，而是非恶性的组织异常。本研究结果提示，利用cfDNA预测肿瘤组织的CDC73基因突变具有可行性，且被认为是PC诊断标志物的CDC73基因，是cfDNA中唯一的关键突变基因。但cfDNA能否直接用于预测肿瘤组织的CDC73基因型，仍需扩大样本量进一步验证。
此外，4例患者（3例PC、1例PA）的血浆cfDNA中检测到CDC73基因突变，但通过NGS检测和副纤维蛋白染色，其匹配的肿瘤组织中未发现CDC73异常。解读cfDNA筛查结果的一大生物学难点在于，大部分健康人群的血浆cfDNA中也能检测到低水平的肿瘤相关DNA突变，这类假阳性结果的成因可能包括体细胞嵌合、克隆性造血和亚克隆突变。肿瘤组织的全外显子测序仅选取部分肿瘤细胞进行检测，可能遗漏未检测部分肿瘤细胞的突变状态；而血浆中的cfDNA是人体所有细胞释放的DNA混合物，其临床意义需从整体角度解读。值得注意的是，4例假阳性病例的血浆cfDNA中均反复检测到一种CDC73基因突变：NM_024529:exon7:c.679_680del: p.R227fs，多位研究者曾在PC、不典型腺瘤或PA组织中检测到该插入缺失突变，且本研究中1例PC患者的该突变为胚系突变。因此笔者推测，该突变位点可能为热点突变，且不会导致蛋白功能完全丧失，在积累大规模cfDNA测序数据前，难以确定该基因型的临床意义。
cfDNA可作为肿瘤患者的监测标志物，有研究报道，胰腺癌患者的cfDNA水平高于健康人群和胰腺囊肿患者。本研究队列中，PA组与PC组患者的血浆cfDNA浓度无显著差异，但利用甲状旁腺肿瘤患者血浆cfDNA的基因突变构建诊断模型时，CDC73基因可有效鉴别PA与PC（AUC=0.795）。目前，血清PTH和钙水平升高、肿瘤体积增大是判断甲状旁腺肿瘤良恶性的辅助指标，将临床数据与cfDNA检测结果结合后，模型的AUC升至0.889。因此，无创生物标志物联合检测有望成为PC术前诊断的有效辅助手段。为进一步评估cfDNA在甲状旁腺肿瘤诊断中的作用，需扩大样本量构建cfDNA突变谱，并结合人类整体遗传背景进行数据分析。
本研究存在一定局限性：第一，由于PC发病率低，尽管本研究的血清分析队列已属较大规模，但样本量仍有限，可能高估或低估部分血清生物标志物的临床意义；第二，在随机选取PA样本时，男性PA患者的样本均未通过DNA质量控制，这可能给统计分析带来一定偏倚；第三，部分血清样本采自复发患者，因多数PC患者在复发后才被确诊，这可能对首次手术前未复发患者的诊断造成误诊风险；第四，本研究为回顾性研究，偏倚难以避免，需开展前瞻性研究进一步评估这些生物标志物的临床推广应用价值。
本研究证实，通过血浆cfDNA深度测序可评估甲状旁腺肿瘤的基因突变状态，血浆cfDNA中的CDC73突变可为PC的术前鉴别诊断提供助力。
“甲状腺癌58基因”、“甲状腺癌80基因检测”、“甲状腺128基因检测”和“实体瘤272基因检测（基础版和PLUS版）”项目，包含CDC73基因E29Dfs*8、R126X、W43X、E53X等突变；此外，“实体瘤1299基因检测”和“实体瘤全外显子组检测”项目都能实现CDC73基因的全部外显子检测，以及准确检出TMB值，更多地指导患者精准治疗。
参考文献：
Zheng, Q., Cui, M., Wang, O. et al. Primary exploration of cell-free DNA in the plasma of patients with parathyroid neoplasms using next-generation sequencing. Cancer Cell Int 25, 86 (2025). https://doi.org/10.1186/s12935-025-03699-w
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